olga:projekte_dna_analyse

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olga:projekte_dna_analyse [2014-02-10 18:37] – humpelolga:projekte_dna_analyse [2025-11-09 09:25] (current) – external edit 127.0.0.1
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 **Protokolle:**{{:olga:human_dna_fingerprinting_protocol.pdf|}} **Protokolle:**{{:olga:human_dna_fingerprinting_protocol.pdf|}}
  
-**Vorbereitungen:** Mix aus 9 RAPD Primern hergestellt 
  
 +\\
 +
 +=== Zellen sammeln und auflösen:===
  
  
 -Mit Wattestäbchen Schleimhautzellen entnehmen -Mit Wattestäbchen Schleimhautzellen entnehmen
 +
 -in einem mit Wasser gefüllten Microtube ausschütteln -in einem mit Wasser gefüllten Microtube ausschütteln
 +
 -5min bei 4000rpm zentrifugieren -5min bei 4000rpm zentrifugieren
 +
 -Die Zellen sammeln sich am Boden, die Flüssigkeit wird weggeschüttet -Die Zellen sammeln sich am Boden, die Flüssigkeit wird weggeschüttet
 -Zellen in 400µl Lysis Buffer auflösen ((50 mM TRIS-Cl pH 8, 10 mM EDTA, 2% SDS)) -Zellen in 400µl Lysis Buffer auflösen ((50 mM TRIS-Cl pH 8, 10 mM EDTA, 2% SDS))
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     *60mg SDS hinzufügen.     *60mg SDS hinzufügen.
     *Davon dann 400µl nehmen.     *Davon dann 400µl nehmen.
 +
 -5 Minuten auf 65° aufheizen (Wasserbad) -5 Minuten auf 65° aufheizen (Wasserbad)
  
-Magnetische Dna Beads vorbereiten:+=== Magnetische Dna Beads vorbereiten: === 
  
 -Magnetische Beads mit 1ml destilliertem Wasser in Microtube mischen -Magnetische Beads mit 1ml destilliertem Wasser in Microtube mischen
 +
 -Magnet an die Seite des Microtubes halten  -Magnet an die Seite des Microtubes halten 
 +
 -60 Sekunden warten, bis alle Beads an der Wand gesammelt sind -60 Sekunden warten, bis alle Beads an der Wand gesammelt sind
 +
 -Wasser mit Pipette absaugen und Waschvorgang 3x mit frischen Wasser wiederholen -Wasser mit Pipette absaugen und Waschvorgang 3x mit frischen Wasser wiederholen
 +
 -Beads mit 50µl destilliertem Wasser mischen und vortexen -Beads mit 50µl destilliertem Wasser mischen und vortexen
  
-DNA ausfällen, an Beads binden, waschen:+ 
 +=== DNA ausfällen, an Beads binden, waschen: === 
  
 -400µl einer 70% Isopropanol Lösung zum Microtube mit den Zellen geben -400µl einer 70% Isopropanol Lösung zum Microtube mit den Zellen geben
 +
 -Beads-Lösung und Zell-Lösung mischen -Beads-Lösung und Zell-Lösung mischen
 +
 -2-10 Minuten warten -2-10 Minuten warten
 +
 -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden. -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden.
 +
 -Flüssigkeit absaugen -Flüssigkeit absaugen
 +
 -800µl 70% Isopropanol zu den Beads hinzufügen, 10 Sekunden vortexen -800µl 70% Isopropanol zu den Beads hinzufügen, 10 Sekunden vortexen
 +
 -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, Isopropanol absaugen -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, Isopropanol absaugen
 +
 -Waschvorgang midnestens 2x wiederholen -Waschvorgang midnestens 2x wiederholen
  
-DNA in Lösung bringen:+=== DNA in Lösung bringen: === 
  
 -20-200µl destilliertes Wasser oder TAE Puffer hinzufügen -20-200µl destilliertes Wasser oder TAE Puffer hinzufügen
 +
 -2-10 minuten warten, mehrmals mischen -2-10 minuten warten, mehrmals mischen
 +
 -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden
 +
 -Flüssigkeit mit gelöster DNA absaugen und in neue Microtube -Flüssigkeit mit gelöster DNA absaugen und in neue Microtube
  
  
-DNA einfärben(optional):+=== DNA einfärben(optional): === 
  
 -zu 500µl DNA Löung 50µl Natriumacetat geben (3 M, pH 5,2)  -zu 500µl DNA Löung 50µl Natriumacetat geben (3 M, pH 5,2) 
 +
 -Vortexen -Vortexen
 +
 -Zusatz von 6 μl (30 μg) Fällungszusatz Roti PinkDNA -Zusatz von 6 μl (30 μg) Fällungszusatz Roti PinkDNA
 +
 -Vortexen -Vortexen
 +
 -Zusatz von 1 Volumina Isopropanol 70% -Zusatz von 1 Volumina Isopropanol 70%
 +
 -Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. -Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
 +
 -Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min. -Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min.
 +
 -Überstand sorgfältig abnehmen -Überstand sorgfältig abnehmen
 +
 -Waschen des Pellets mit ca. 1 Vol. 70 % Isopropanol -Waschen des Pellets mit ca. 1 Vol. 70 % Isopropanol
 +
 -Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min. -Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min.
 +
 -Überstand sorgfältig abnehmen -Überstand sorgfältig abnehmen
--Anzentrifugieren des Pellets, um das restliche Ethanol in der Spitze des Röhrchens zu sammeln + 
-(ca. 10 sec.)+-Anzentrifugieren des Pellets, um das restliche Ethanol in der Spitze des Röhrchens zu sammeln (ca. 10 sec.) 
 -Restlichen Überstand sorgfältig abnehmen -Restlichen Überstand sorgfältig abnehmen
 +
 -Trocknen des Pellets bei Raumtemperatur (ca. 3 min.) -Trocknen des Pellets bei Raumtemperatur (ca. 3 min.)
--Resuspendieren in geeigentem Puffer (steriles + 
-Wasser, 10 mM Tris-Puffer, TE-Puffer)+-Resuspendieren in geeigentem Puffer (steriles Wasser, 10 mM Tris-Puffer, TE-Puffer)
  
    
-PCR:+=== PCR: === 
  
 -2µM Primer (2µl), 25µl OneTaq 2x Mastermix und 23µl DNA Lösung mischen -2µM Primer (2µl), 25µl OneTaq 2x Mastermix und 23µl DNA Lösung mischen
 +
 -30 Zyklen, jeweils ca. 1 Minute pro Temperaturschritt im Thermocycler durchlaufen lassen -30 Zyklen, jeweils ca. 1 Minute pro Temperaturschritt im Thermocycler durchlaufen lassen
  
  
-Gel-Elektrophorese:+=== Gel-Elektrophorese: === 
  
  
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 -in Kammer gießen -in Kammer gießen
 +
 -Gel aushärten lassen und Kammer mit 1x TAE Puffer füllen -Gel aushärten lassen und Kammer mit 1x TAE Puffer füllen
 +
 -DNA Lösung, Ladepuffer und DNA Farbstoff mischen  -DNA Lösung, Ladepuffer und DNA Farbstoff mischen 
 +
 -Box anschließen und laufen lassen -Box anschließen und laufen lassen
  
 +{{tag>project olga dna pcr}}
  • /srv/dokuwiki/data/attic/olga/projekte_dna_analyse.1392057450.txt.gz
  • Last modified: 2025-11-09 09:24
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