olga:projekte_dna_analyse

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 **Protokolle:**{{:olga:human_dna_fingerprinting_protocol.pdf|}} **Protokolle:**{{:olga:human_dna_fingerprinting_protocol.pdf|}}
  
-**Vorbereitungen:** Mix aus 9 RAPD Primern hergestellt 
  
 +\\
 +
 +=== Zellen sammeln und auflösen:===
 +
 +
 +-Mit Wattestäbchen Schleimhautzellen entnehmen
 +
 +-in einem mit Wasser gefüllten Microtube ausschütteln
 +
 +-5min bei 4000rpm zentrifugieren
 +
 +-Die Zellen sammeln sich am Boden, die Flüssigkeit wird weggeschüttet
 +-Zellen in 400µl Lysis Buffer auflösen ((50 mM TRIS-Cl pH 8, 10 mM EDTA, 2% SDS))
 +    *100µl 10x TAE Puffer auf 3ml mit Wasser verdünnnen.
 +    *60mg SDS hinzufügen.
 +    *Davon dann 400µl nehmen.
 +
 +-5 Minuten auf 65° aufheizen (Wasserbad)
 +
 +=== Magnetische Dna Beads vorbereiten: ===
 +
 +
 +-Magnetische Beads mit 1ml destilliertem Wasser in Microtube mischen
 +
 +-Magnet an die Seite des Microtubes halten 
 +
 +-60 Sekunden warten, bis alle Beads an der Wand gesammelt sind
 +
 +-Wasser mit Pipette absaugen und Waschvorgang 3x mit frischen Wasser wiederholen
 +
 +-Beads mit 50µl destilliertem Wasser mischen und vortexen
 +
 +
 +=== DNA ausfällen, an Beads binden, waschen: ===
 +
 +
 +-400µl einer 70% Isopropanol Lösung zum Microtube mit den Zellen geben
 +
 +-Beads-Lösung und Zell-Lösung mischen
 +
 +-2-10 Minuten warten
 +
 +-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden.
 +
 +-Flüssigkeit absaugen
 +
 +-800µl 70% Isopropanol zu den Beads hinzufügen, 10 Sekunden vortexen
 +
 +-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, Isopropanol absaugen
 +
 +-Waschvorgang midnestens 2x wiederholen
 +
 +=== DNA in Lösung bringen: ===
 +
 +
 +-20-200µl destilliertes Wasser oder TAE Puffer hinzufügen
 +
 +-2-10 minuten warten, mehrmals mischen
 +
 +-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden
 +
 +-Flüssigkeit mit gelöster DNA absaugen und in neue Microtube
 +
 +
 +=== DNA einfärben(optional): ===
 +
 +
 +-zu 500µl DNA Löung 50µl Natriumacetat geben (3 M, pH 5,2) 
 +
 +-Vortexen
 +
 +-Zusatz von 6 μl (30 μg) Fällungszusatz Roti PinkDNA
 +
 +-Vortexen
 +
 +-Zusatz von 1 Volumina Isopropanol 70%
 +
 +-Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
 +
 +-Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min.
 +
 +-Überstand sorgfältig abnehmen
 +
 +-Waschen des Pellets mit ca. 1 Vol. 70 % Isopropanol
 +
 +-Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min.
 +
 +-Überstand sorgfältig abnehmen
 +
 +-Anzentrifugieren des Pellets, um das restliche Ethanol in der Spitze des Röhrchens zu sammeln (ca. 10 sec.)
 +
 +-Restlichen Überstand sorgfältig abnehmen
 +
 +-Trocknen des Pellets bei Raumtemperatur (ca. 3 min.)
 +
 +-Resuspendieren in geeigentem Puffer (steriles Wasser, 10 mM Tris-Puffer, TE-Puffer)
 +
 + 
 +=== PCR: ===
 +
 +
 +-2µM Primer (2µl), 25µl OneTaq 2x Mastermix und 23µl DNA Lösung mischen
 +
 +-30 Zyklen, jeweils ca. 1 Minute pro Temperaturschritt im Thermocycler durchlaufen lassen
 +
 +
 +=== Gel-Elektrophorese: ===
 +
 +
 +
 +-1X TAE Puffer für Gelelektrophorese (500 ml)
 +   *2,42g Tris in 250ml dH20 lösen
 +   *0,185g EDTA darin lösen
 +   *0,57ml Eisessig (17,4M) zugeben
 +   *Auf 500ml mit dH2O auffüllen
 +
 +-Agarosegel (1%) für Kammer(50ml) herstellen
 +  *50ml von 1X TAE Puffer entnehmen
 +  *0,5g Agarose zugeben und in Mikrowelle aufschmelzen
 +
 +-in Kammer gießen
 +
 +-Gel aushärten lassen und Kammer mit 1x TAE Puffer füllen
 +
 +-DNA Lösung, Ladepuffer und DNA Farbstoff mischen 
 +
 +-Box anschließen und laufen lassen
 +
 +{{tag>project olga dna pcr}}
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